半胱氨酸蛋白酶ATG4B在自噬機(jī)制中起關(guān)鍵作用，而人類ATG4B在癌癥的發(fā)展中至關(guān)重要，因而成為潛在的治療靶標(biāo)蛋白。

Stefanie Peter等人的研究中，基于HUWE1的HECT結(jié)構(gòu)域自身泛素化，對(duì)HUWE1測定活性體外以進(jìn)行小分子高通量篩選。首先，從840,243種化合物中，篩選出2,765個(gè)具有HUWE1抑制活性的hit。重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，鑒定出了UBA1或UbcH5b的抑制劑。研究人員在HUWE1和NEDD4自身泛素化測定中確定劑量反應(yīng)，并且去除了抑制NEDD4自泛素化的化合物。這一系列實(shí)驗(yàn)中鑒定出了HUWE1的抑制劑BI8622(IC50=3.1μM)。此外，BI8622可誘導(dǎo)HUWE1異位表達(dá)以去除HeLa細(xì)胞中MCL1的泛素化(IC50=6.8μM)。BI8622還抑制Ls174T細(xì)胞的集落形成(IC50≈8.4μM)。

注意事項(xiàng)

• 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

• 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

• 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

• 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。

• 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。

• 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

• 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

• 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。

• 不能使用過期產(chǎn)品。

• 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。